Что вызывает сегодня вспышки острого вялого паралича, если в мире обнаруживается так мало полиовируса?
Каждый ребенок начала 1950-х гг. наверняка помнит полиомиелитную панику, которая неизменно охватывала нацию в самые жаркие летние дни, приводя к закрытию публичных мест и визитам врача при первых признаках тугоподвижности шеи или отказывающейся идти ноге. Память о страхе при слове «полиомиелит», произнесенном шепотом, до сих пор живет где-то глубоко внутри меня, почти как страх при воспоминании о школьных упражнениях «спрячься-накройся» во времена Холодной войны.
Теперь наша вера в то, что фанерные парты и пухлые детские ручки могли защитить школьников от ядерной атаки, кажется очень забавной. Однако наш иррациональный страх перед полиовирусом продолжает существовать, несмотря на ВОЗовские программы искоренения в отдаленных уголках стран третьего мира, где, как считается, притаился полиовирус. Одной из причин такого длительного беспокойства являются остающиеся широко распространенными острые вялые параличи — наиболее калечащее проявление болезни, которое может лишить жертву возможности контролировать целые группы мышц, даже тех, с помощью которых мы дышим.
На весь мир прозвучал тревожный сигнал о полиомиелите в первый день 2001 г., когда органы здравоохранения сообщили о новой эпидемии, разразившейся на острове Гаити, где расположены государства Гаити и Доминиканская Республика. Дэвид Браун сообщил в «Вашингтон Пост», что, оказывается, во второй половине 2000 г. на этом карибском острове свирепствовал полиовирус-«мутант», производный штамма оральной полиовакцины. Когда Центр контроля и предотвращения заболеваний США (CDC) исследовал эти случаи, обнаружилась другая загадка: лишь треть случаев паралича была связана с полиовирусом. Центр контроля заболеваний идентифицировал 19 человек из Доминиканской Республики, у которых развился острый вялый паралич (ОВП, характерный симптом полиовирусной инфекции, а также самостоятельный синдром) между 12 июля и 18 ноября 2000 г. Однако полиовирус был найден только у шести из них. Причина остальных случаев паралича остается неизвестной.
Дело становится еще загадочнее, когда мы исследуем статистику Всемирной организации здравоохранения по ОВП и полиовирусной инфекции в Доминиканской Республике за последние несколько лет. Хотя число случаев ОВП в Доминиканской Республике с 1996 по 1999 год варьируется от 4 до 24, полиовирус не был обнаружен ни разу.
Если мы далее исследуем статистику ВОЗ полиовирусных ОВП, а также ОВП, в которых не был определен вирус, становится очевидным поразительный факт: на сегодня в мире большинство случаев острого вялого паралича НЕ связано с полиовирусом.
Этот факт поднимает новые интригующие вопросы, включая и такой: а была ли вообще когда-либо эпидемия полиовирусной инфекции в Соединенных Штатах и Канаде? Уточним, что имелось резко возросшее количество случаев ОВП, и при этом участь многих детей (и некоторых взрослых) была трагичной: они были парализованы или умерли. Поскольку многие из этих случаев сопровождались основными признаками типичной полиовирусной инфекции — лихорадкой, тугоподвижностью шеи и спины, сильной головной болью, мышечными болями, ангиной, в тяжелых случаях параличом, и носили групповой характер, — они были приписаны легко передаваемому полиовирусу.
Но так ли это в действительности? Если нет, то что же сегодня является действительной причиной стольких страданий в тех уголках мира, которые хуже всего приспособлены справляться с ними? Правильно ли считать, что именно полиовирус вызывает большинство случаев паралича?
Что такое полиомиелит?
Слово «полиомиелит» происходит от двух греческих слов: «полио», что значит серый, и «миелит» — воспаление спинного мозга. Полиомиелит может калечить и убивать подверженных заболеванию людей, особенно детей, за считанные дни. Ему чаще подвержены самые маленькие, поэтому его также называют «детским параличом». У некоторых развиваются симптомы, похожие на грипп без паралича, что может привести к «вирусному менингиту» (отеку оболочек, окружающих мозг). Для такой полиомиелитной «малой болезни» (как ее называют) характерны небольшая лихорадка, недомогание, головная боль, ангина и тошнота; пациенты обычно выздоравливают полностью в течение 24-72 часов. Клиническая картина непаралитической формы полиомиелита не отличается от вирусного менингита, вызванного другими инфекционными агентами. К удивлению, менее одного из 100 (а возможно и всего лишь 1 из 1000) случаев инфицирования полиовирусом приводит к ясно различимому заболеванию, даже во время вспышек23,24.
«Большой полиомиелит» обычно развивается внезапно, с лихорадкой, искривлением шеи и спины, сильной головной болью и мышечными болями. Большая болезнь может привести к потере сухожильных рефлексов и ассиметричной слабости или параличу.
Обычно полиомиелит клинически диагностируется по присутствию высокой температуры и острому ассиметричному вялому параличу, который развивается в течение 2-4 дней вслед за температурой и мышечными болями. Приблизительно 50% людей, заболевших паралитической формой полиомиелита, остаются искалеченными на всю жизнь24. Паралич, вызванный полиомиелитом, происходит из-за воспаления и разрушения двигательных нейронов в сером веществе спинного и головного мозга. Вид или степень паралича зависит от местоположения и степени разрушения двигательного нейрона, и может варьироваться от минимальных до тяжелых форм паралича конечностей и паралича мышц, которые позволяют нам дышать. В 1940-х и 1950-х годах применялись аппараты искусственного дыхания («железные легкие») для помощи детям, которые не могли сами дышать. Несмотря на пугающий вид «железных легких» на старых фотографиях, многие дети выздоровели полностью. Тем не менее, паралитический полиомиелит смертелен в 2-10% случаев24.
За исключением пациентов с дыхательной недостаточностью, лечение полиомиелита симптоматическое: ненаркотические болеутоляющие, горячие обертывания и физиотерапия.
Что такое полиовирус?
Несмотря на разрушительное воздействие на нервные ткани, полиовирус был отнесен к семейству энтеровирусов, живущих в желудочно-кишечном тракте. Он состоит из одной цепочки РНК, заключенной в протеиновую оболочку, которая защищает его от воздействия окружающей среды (инактивации). Полиовирус довольно мал по вирусным стандартам (22-32 нанометра). Считается, что люди являются единственными носителями полиовируса, поэтому ВОЗ запустила программу искоренения. Согласно Центру контроля заболеваний, с 1979 г. в США подтвержденные случаи полиовирусного паралича были связаны только с оральной полиовакциной, содержащей живой вирус24,31. В сущности, Центр контроля заболеваний делает теперь заключение, что «как лабораторный контроль за энтеровирусами, так и наблюдения за случаями полиомиелита позволяют предположить, что эндемичная циркуляция природного дикого полиовируса прекратилась в США в 1960-х гг.»24 Другие исследователи ставят под вопрос вывод Центра контроля заболеваний о том, что циркуляция дикого полиовируса действительно прекратилась в Соединенных Штатах сорок лет назад.
В поисках инфекционного агента полиомиелита
Полиомиелит стал предметом серьезного общественного беспокойства, когда он впервые распространился по восточному побережью США, а также в промышленных районах Европы в начале 1900-х гг. Его необъяснимые вспышки пугали и публику, и медперсонал, что продемонстрировали Саймон Флекснер и Пол А. Льюис (оба из Рокфеллеровского Института медицинских исследований в Нью-Йорке), написавшие в «Журнале Американской медицинской ассоциации» в 1909 г.: «Причина и способ распространения заболевания [полиомиелита] неизвестны, поэтому не существует разумных способов его предотвращения. Хотя тяжесть и фатальность протекания заболевания колеблются в широких пределах, его последствия всегда столь разрушительны, что делают его важнейшим для медицины и общества».
Как раз за год до этого австрийские исследователи Карл Ландштейнер и Эрвин Поппер совершили исторический прорыв в изучении полиомиелита. У Ландштейнера был девятилетний пациент, больной полиомиелитом, который умер 18 ноября 1908 г., спустя всего 4 дня после начала заболевания. С помощью своего коллеги Поппера, Ландштейнер приготовил суспензию из спинного мозга ребенка и ввел ее двум обезьянам, а также нескольким кроликам, морским свинкам и мышам. Оказалось, что в то время, как у других животных не было никаких последствий от инъекции материала спинного мозга, у двух обезьян развилось поражение спинного и головного мозга, которое выглядело неотличимым от такового у людей, страдающих полиомиелитом. У одной из обезьян развился острый вялый паралич в обеих ногах. Хотя Ландштейнер и Поппер попытались передать паралич другим обезьянам, используя ткани нервной системы больных обезьян — это называется пассажем инфекционного агента — они потерпели неудачу.
На следующий год Флекснеру и Льюису удалось то, что не удалось Ландштейнеру и Попперу: первые сообщили в «Журнале Американской медицинской ассоциации», что они успешно провели полиомиелит через несколько обезьян (т.е. от обезьяны к обезьяне). Они начали, подобно Ландштейнеру и Попперу, с введения тканей спинного мозга больных людей в головной мозг обезьян. После того, как обезьяна заболевала, они вводили суспензию из пораженных тканей ее спинного мозга другим обезьянам. Работа Флекснера и Льюиса в 1909 г. была признана прорывом, потому что у второй обезьяны (и у третьей, и у четвертой, и по меньшей мере у шести к моменту публикации) развился полиомиелит. Флекснер и Льюис успешно перенесли инфекционный компонент заболевания от животного к животному.
Но что было передаваемым агентом? «Ни в препаратах-мазках, ни в культурах нам так и не удалось обнаружить бактерию, которая могла бы быть причиной заболевания», — сообщили Флекснер и Льюис. Поэтому они сделали вывод, что «инфекционный агент эпидемического полиомиелита относится к классу мельчайших фильтрующихся вирусов, которые пока невозможно с уверенностью разглядеть в микроскоп».
Удалось ли Флекснеру и Льюису выделить полиовирус в 1909 г.? Сегодня очевидно, что в ранних экспериментах при попытках создания чистого препарата полиовируса вполне могли присутствовать другие агенты.
Дебаты о природе причинного агента полиомиелита продолжались. Одна группа исследователей предположила в 1919 г., что разновидность бактерии, осторожно названной полиококком, была либо виновником, либо кофактором. В ранних экспериментах все виды биологических материалов — спинной и головной мозг, фекальный материал, даже насекомые — измельчались и вводились в обезьян, чтобы вызвать паралич. Было известно, что эти ранние «вирусные препараты» содержали бактерии. Количество бактерий определялось путем засевания тканевой культуры в чашке Петри эмульсией спинного мозга (или фекального материала), чтобы измерить, сколько времени потребуется для появления бактериальных колоний. Как указали Ф. Б. Гордон и соавт. в статье, опубликованной в «Журнале инфекционных болезней», «если приблизительно через 22 часа инкубации при температуре 370С не происходило роста [бактерий], образец считался подходящим для введения обезьянам. Это не было тестом на стерильность, т.к. рост обычно происходил при более длительной инкубации; скорее, это было указанием на степень бактериального заражения образца».
Таким образом, первые исследователи полиовируса знали, что «вирус», который они вводили обезьянам, содержал также неопределенное количество бактерий. У них не было возможности определить, что еще там может присутствовать.
В то время как Флекснер и Льюис могли ошибаться, предполагая, что у обезьян они переносили очищенную форму «фильтрующегося вируса», они определенно передавали болезнетворный агент или агенты от животного к животному. Хотя они не могли наблюдать этот агент, они предельно детально, насколько смогли, дали его описание. Несомненно полагая, что оказывают услугу другим исследователям, они сделали выводы таким образом, который на десятилетия стал определяющим для исследований полиомиелита.
В начале XX в., когда ученые предпринимали первые попытки понять и охарактеризовать вирусы и вирусные заболевания, многие — включая таких исследователей полиомиелита, как Флекснер и Льюис — преувеличивали значение своих находок.
Первые исследователи полиомиелита были настоящими пионерами в науке: Флекснер, Льюис, Дальдорф, Ландштейнер, Поппер, Дульбекко, Сэбин, Солк и многие другие работали над неизвестным агентом. Они не понимали свойства зараженных тканей, с которыми имели дело, и они не знали, как защитить себя от болезней, которые могли быть в этих тканях. В наше время латексных перчаток, биобезопасных камер и других легкодоступных способов защиты от опасных инфекционных агентов, нельзя переоценить храбрость этих ученых и их риск.
Тем не менее, отсутствие точности в описаниях экспериментов и их результатов не позволяет нам слепо доверять исследователям начала XX в.
Например, в 1948 г. Гилберт Дальдорф и Грейс М. Сиклз из Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк опубликовали доклад об исследованиях, который иллюстрирует некоторые проблемы в вирусологии, существующие по сей день. Дальдорф и Сиклз дали описание «неизвестного фильтрующегося агента», который они «выделили» из фекалий парализованных детей6.
Проблемы становятся очевидными, когда Дальдорф и Сиклз описывают, как они «выделили» этот агент:
«Двадцать процентов фекальной суспензии, приготовленной путем обработки эфиром и центрифугированием, были введены в мозг лабораторных мышей-альбиносов. Мышей грудного возраста, 3-7 дней от роду, парализовало, а мышей весом 10-12 г — нет. Выделение было повторено несколько раз…».
Дальдорф и Сиклз использовали слово «выделение» для описания создания суспензии из фекального материала, что было, мягко говоря, сильным преувеличением.
Дальдорф и Сиклз попытались затем идентифицировать агент. В 1948 г. антитела, как и вирусы, не могли быть определены так, как их определяют сегодня. Чтобы различить вирусные штаммы, была использована «нейтрализующая сыворотка» — бесклеточная порция крови, взятая у человека или животного, предположительно зараженного агентом. Вероятно, эта нейтрализующая сыворотка содержала антитела к агенту.
Согласно Дальдорфу и Сиклз, нейтрализующая сыворотка, полученная от парализованных детей, не давала развиться параличу у мышей, когда им ее вводили одновременно с неидентифицированным агентом. Отсутствие симптомов (у мышей не развился паралич) было интерпретировано таким образом, что нейтрализующая сыворотка (т.е. иммунный ответ, выработанный больным ребенком) успешно блокировала введенный в мышь агент. Не было доказательства тому, что нейтрализующая сыворотка, как утверждали Дальдорф и Сиклз, взаимодействовала и подавила один специфический агент.
Дальдорф и Сиклз верили, что они «выделили» легендарный агент, который мог заражать людей, хотя они не доказали, что он был ответственен за развитие паралича у пациентов. «Изученные нами пациенты могли быть случайно инфицированы новым агентом и классическим полиомиелитным вирусом, хотя изолятам не удалось вызвать заболевание макаки резус», — писали они. И опять, они писали о «выделении», когда имели в виду получение частично обработанного образца (спинного мозга или фекалий) у парализованного человека и введение его животному с тем, чтобы посмотреть, вызовет ли разведенный образец паралич. Настоящего выделения не было.
Был ли вообще выделен полиовирус?
В современной медицине существует догма, что полиовирус выделен, описан, полностью изучен и ныне близок к исчезновению благодаря агрессивным вакцинно-искоренительным программам. Однако, как показала недавняя вспышка в Доминиканской Республике, мы можем быть не так близки к искоренению полиомиелита, как нас хотят в этом убедить.
Более того, хотя агент, идентифицируемый как полиовирус, был культивирован в конце 1940-х, знаем ли мы наверняка, что он был действительно выделен, т.е. выращен в чистом виде без примесей? Мы знаем, что случайные вирусы («попутчики»), как например SV-40, часто встречаются в тканях обезьяны, которые первые исследователи полиовируса использовали в качестве клеточной культуры. И хотя эти агенты, очевидно, не приносили никакого вреда обезьянам, отсроченное влияние их на человека еще предстоит определить.
Примерно через 90 лет после сообщения Ландштейнера и Поппера об успешном заражении обезьян полиомиелитом, д-р Вольфганг К. Йоклик вернулся к великим научным достижениям XX века с точки зрения определяющей науки последнего, вирусологии19. Поводом послужили совпавшие 100-летние юбилеи Американского общества микробиологии и собственно вирусологии. Работая главным редактором «Вирусологии» и редактором «Журнала вирусологии» после долгой карьеры в качестве профессора микробиологии, Йоклик имел уникальную возможность (как он сам отмечал) оценить, что же нового узнали со времен первых опытов по вирусологии.
Перед основанием «Вирусологии» и «Журнала вирусологии» в 1950-х и 1960-х гг. соответственно, Йоклик отмечал «ряд эпохальных открытий в вирусологии», появившихся в журналах другой тематики. Среди семи выделенных им открытий были два, связанных с исследованием паралича. Первым было «открытие Эндерса и соавт. в 1949 г., что вирус полиомиелита может быть выращен на клеточных тканях человеческого эмбриона, культивированных in vitro, что создало основу техники выращивания на тканевой культуре (моноклеточной культуре)». Вторым — «Дульбекко, также в 1952 г., продемонстрировал, что вирус животных был способен формировать пятна в монослоях клонированных клеточных культур, и это открыло область молекулярной вирусологии животных». И хотя само исследование Дульбекко в 1952 г. не включало в себя полиовирус, оно напрямую привело его к работе 1954 г., в которой он применил новую методологию к изучению полиовируса.
В 1949 г., как рассказывал Йоклик, исследователь с медицинского факультета Гарвардского университета Джон Ф. Эндерс со своими коллегами Томасом Г. Веллером из Службы общественного здравоохранения США и Фредериком К. Роббинсом, старшим членом Национального исследовательского совета по вирусным заболеваниям, продемонстрировали не только способность полиовируса расти на клеточных культурах, но и его способность размножаться вне нервных тканей — в то время это было ошеломляющим открытием. Уже подозревали, что полиовирус часто присутствует в кишечнике заболевших людей. Однако никому не удавалось размножить вирус в тканях кишечного тракта, главным образом из-за бактерий, которые естественным образом живут там. Успех частично сопутствовали Эндерсу и его коллегам, потому что они добавили антибиотик (пенициллин или стрептомицин) в свои клеточные культуры, чтобы убить бактерии — техника, которая, разумеется, до второй мировой войны была недоступна исследователям.
Несмотря на то, что работа Эндерса и его коллег 1949 г. общепризнана как поворотный пункт в исследовании полиомиелита (многие, в том числе исследователи из ВОЗовской программы искоренения полиомиелита, воздают должное ей как проложившей путь для разработки полиовакцин Сэбина и Солка), полиовирус не был выделен и этими исследователями. Они успешно вырастили на эмбриональных тканях «фильтрующиеся агенты», которые они считали полиовирусом. Как Ландштейнер и Поппер 40 годами ранее, и как почти все исследователи в этой области в течение первых примерно 60 лет, Эндерс и его сотрудники называли эту передающую заболевание суспензию «вирусом».
Несмотря на это преувеличение, Эндерс, Веллер и Роббинс первыми доказали, что инфекционный агент, связанный с полиомиелитом, может быть выращен в клетках в лаборатории, и что клеточные культуры могут заменить живых животных для изучения таких передающихся агентов. В 1954 г. за эту новаторскую работу им была присуждена Нобелевская премия.
Считается, что работа Ренато Дульбекко 1952 г., отмеченная Йокликом, внесла весомый вклад в вирусологию вообще и в исследование полиовируса в частности. Работая в Калифорнийском технологическом институте в Пасадене, Дульбекко разработал метод выращивания клеток в чашках Петри таким образом, что «вирусные пятна» стали видны. Он вырастил пятна вируса западного лошадиного энцефаломиелита на субстрате куриных эмбриональных клеток и в опубликованной статье указал, что по-прежнему неизвестно, все ли вирусы можно ли культивировать подобным образом. Это было самое начало современных исследований в вирусологии, и Дульбекко выразил надежду, что однажды исследователи смогут различать различные вирусы, выращенные на клеточной культуре, используя его методологию и исследуя образовавшиеся пятна под микроскопом9.
Эксперимент Дульбекко по «выделению»
В 1954 г. Дульбекко и его коллега Маргарет Фогт опубликовали классическую исследовательскую статью, которая, как считается, на десятилетия вперед установила стандарт очистки полиовируса. В ней было представлено техническое нововведение в процесс «очистки» вирусов от тканевой культуры. Новая техника была названа «очисткой пятна». Отдельное пятно (область клеток округлой формы, окрашенная иначе, чем окружающая культура) предлагалось считать популяцией чистого вируса. В очистке пятна использовалась трипсинизация, которая включает в себя обработку клеток, в данном случае клетки обезьяньей почки, ферментами трипсина, расщепляющими любую образовавшуюся группу клеток, в результате чего получали моноклеточную суспензию.
На заре исследований полиовируса тканевая культура обычно извлекалась из обезьяньих почек (или обезьяньих яичек). Дульбекко и Фогт объяснили, откуда взялся «вирус», который они вырастили:
«Вирус поставлялся в виде 20% суспензии спинного мозга макаки резус в дистиллированной воде. Использовался 1-й тип вируса, полученный пассажем через однослойные почечные культуры. 2-й тип, штамм Йель-Эс-Кей (Yale-SK), и тип 3, штамм Леон (Leon), в форме надосадочных клеточных культур любезно предоставил д-р Дж. Л. Мельник».
Другими словами, Дульбекко и Фогт не выделили полиовирус в чистом виде ни в одном из экспериментов, описанных в этом докладе 1954 г. Хотя они писали о засевании своих культур «вирусом», на самом деле они использовали неочищенные суспензии, а не чистые вирусные изоляты.
Как только обезьяньи почки измельчались до «отдельных клеток, клеточных кластеров и клеточных осколков», их засевали эмульсией обезьяньего спинного мозга. Появление пятен свидетельствовало о росте вируса, согласно модели, разработанной Дульбекко в 1952 г.
Проверкой эксперимента была обработка культур обезьяньей антисывороткой (полученной от обезьян, зараженных 1-м, 2-м или 3-м типом полиовируса); если антисыворотка 1-го типа подавляла образование пятен, а антисыворотки для 2-го и 3-го типов нет, то считалось, что в культуре присутствует только полиовирус 1-го типа. Другими словами, было принято считать, что никакие другие организмы или связанные с заболеванием агенты не размножались на культуре.
Еще раз: то, что Дульбекко и Фогт описывают как «выделение» полиовируса, не является выделением с точки зрения современной микробиологии. Чтобы произвести «очистку пятна», они просто набирали пипеткой немного жидкости («пятносодержащего препарата») на пластинке с одной культурой и добавляли на пластинки с другими культурами. Когда клеточные культуры второго поколения очевидно демонстрировали рост вируса (т.е. пятен), обезьяны прививались пятносодержащим препаратом. У привитых обезьян развивался паралич и впоследствии большинство умирали. Поскольку препарат с пятнами очищенного вируса не только давал рост новых пятен во втором поколении клеточных культур, но и вызывал вялый паралич у обезьян, Дульбекко и Фогт сделали вывод, что они «выделили» полиовирус.
Ясно, что как и предыдущие исследователи полиовируса, Дульбекко и Фогт размножали в своих тканевых культурах связанные с заболеванием вещества, и что они переносили эти вещества обезьянам, у которых развивался вялый паралич. Это были впечатляющие достижения.
Заявления Дульбекко и Фогт, однако, шли дальше того, что позволяли факты. Они утверждали, что не только выделили полиовирус, но и что «поскольку каждый пятносодержащий препарат происходил от моновирусной частицы (как доказано в «Дискуссии»), эти препараты являются самыми чистыми источниками вируса, доступными в настоящее время».
Почему же они решили, что «моновирусная частица», которую они никогда не видели и не измеряли, вызвала рост именно одного пятна на их культуре? В доказательство того, что каждое пятно произошло от моновирусной частицы, Дульбекко и Фогт приводили математическое уравнение: они установили зависимость определенной концентрации вируса в клеточной культуре от количества разведений первоначальной жидкости (например, суспензии обезьяньего спинного мозга). Чем меньше раз была разведена жидкость, тем больше пятен вырастало в лабораторных культурах. Чем больше раз разводилась жидкость, тем меньше пятен росло. Математическая модель Дульбекко и Фогт предполагала такую линейную зависимость между разведением пятносодержащего препарата и числом образующихся пятен, и когда они достигали наибольшего разведения, при котором все же формировалось одно пятно, они считали, что там присутствовала лишь одна «вирусная частица». И что же стало обещанным доказательством этого? Их математическая модель. Это прекрасный пример тавтологического доказательства. Его самым очевидным слабым звеном является то, что математическая модель не различала и не могла различить «моновирусную частицу» и биологический комплекс, который мог содержать моновирус.
Это становится ясно из описания, данного Дульбекко и Фогт пятнообразующей «моновирусной частице», которую они считали выделенной:
«Теперь стало возможным дать правильную характеристику вирусной частице, обнаруживаемой при помощи пятна. Благодаря эффекту «все или ничего», она имеет признаки частицы. Это соответствует единице вируса, которая не поддается дальнейшему разделению при высоких разведениях. Исходя из этого определяющего свойства, мы назвали это пятнообразующей частицей. Мы не знаем ее морфологические или генетические свойства. Это может быть единичный микроорганизм, или их группа, при условии, что группа неопределимо присутствует при высоких разведениях…».
Сегодня кажется странным, что Дульбекко и Фогт допускали возможность того, что они обнаружили «группу» материалов, а потом игнорировали это. Что, если другой вид вируса также присутствовал в этих частицах? Или генетический материал хозяина присоединялся к частице, формируя «группу»?
И хотя электронный микроскоп, который позволил бы им увидеть моновирусную частицу, существовал в 1954 г., Дульбекко и Фогт не воспользовались им. Вместо этого, они применили испытанную временем технологию, согласно которой считалось, что вирусы присутствуют в культуре, если определенные химикаты окрашивали ее соответственно, или если жидкости, предположительно содержащие вирусы, демонстрировали стандартный рост характеристик, как например связанные с полиовирусом пятна, описанные здесь. Дульбекко и Фогт не могли определить, что они наблюдали отдельные вирусы в культурах, и поэтому их предположение, что они выделили «моновирусную частицу», было большим преувеличением. Дульбекко и Фогт не выделили полиовирус.
Из этого исторического обзора первых докладов об исследовании полиовируса становится ясно, что никто из исследователей полиомиелита на самом деле не выделил полиовирус. Кроме того, они вводили обезьянам экспериментальные жидкости, которые, возможно, были заражены другими связаннными с болезнью агентами.
Еще больше искажает картину тот факт (не рассматриваемый в настоящей статье), что кроме полиовируса есть и другие энтеровирусы, связанные с ОВП. Например, не далее как в феврале 2001 г. было продемонстрировано, что вирус Коксаки А-24 связан с ОВП неполиовирусного происхождения.
Как часто вялый паралич НЕ вызван полиовирусом?
Впечатляющее количество случаев паралича в мире не связано с полиовирусом. Если вы посетите веб-сайт Всемирной организации здоровья, которая отслеживает связанные и не связанные с полиомиелитом случаи ОВП, вы увидите, что мир не избавился от бича ОВП. Например, Индия сообщила о 9 580 случаях ОВП в 1999 г., 2802 из которых, т.е. менее одной трети, связаны с полиовирусом. Программы искоренения полиовируса и вакцинации не ликвидировали паралич.
Недавно ВОЗ провозгласила Египет страной, стоящей на пороге искоренения полиовируса. «Мы находимся на закате эпохи полиомиелита», — сообщил руководитель проекта Детского фонда ООН информационному агенству новостей Рейтер в конце 2001 г. В Египте «пока что не было сообщено ни об одном случае калечащего вируса в этом году», т.е. в 2000 г., согласно Рейтер.
Согласно веб-сайту ВОЗ по надзору за ОВП и полиомиелитом, в Египте в 2000 г. — самом последнем году, по которому доступна статистика (на момент написания статьи — прим. перев.), — было, однако, 54 случая острого вялого паралича. И хотя в 1999 г. 9 случаев ОВП были классифицированы как случаи полиовирусного происхождения, 276 были классифицированы как не связанные с полиомиелитом. В течение 1998 г. в Египте было 295 случаев ОВП, 35 из которых были классифицированы, как связанные с полиовирусом; в 1997 г. Египет сообщил о 217 случаях не связанного с полиомиелитом паралича в сравнении с 14 случаями, в которых был подтвержден полиовирус; и в 1996 г., самом раннем году, по которому есть статистика, в Египте было 309 случаев острого вялого паралича. Сто из них были классифицированы как связанные с полиовирусом, оставшиеся 209, две трети от общего количества, вероятно были вызваны другим вирусом (учтем, что ни в одной стране мира нет идеально точной эпидемиологической статистики).
Афганистан — еще одна страна с растущим преобладанием случаев ОВП над снижающейся частотой полиовируса. Как отметил Центр контроля заболеваний в своем «Еженедельном докладе о заболеваемости и смертности» (MMWR) 2 марта 2001 г.: «В течение 1999-2000 гг. число случаев ОВП [в Афганистане] выросло с 230 до 253, и число выделенных из них случаев полиовируса уменьшилось с 63 до 28».
Как Центр контроля заболеваний объясняет рост случаев ОВП в Афганистане на фоне решительной кампании по искоренению полиовируса? Да никак. Между прочим, «Еженедельный отчет» преподносит рост случаев не связанных с полиомиелитом ОВП чуть ли не как триумф общественного здравоохранения: «В течении 1999-2000 гг. доля неполиовирусных ОВП почти удвоилась, и число районов, охваченных Национальными днями иммунизации неуклонно росло. Тщательное планирование и надзор за вакцинацией от-дома-к-дому и поддержка все возрастающего числа местных партнеров привело к наибольшему числу когда-либо вакцинированных детей. Наблюдение силами неправительственных организаций, отделений ООН и местных структур улучшило качество Национальных дней иммунизации…». Другими словами, чем больше было Национальных дней иммунизации, тем больше появлялось случаев паралича. Значит ли это, что иммунизация вызывала паралич? Нет, но и растущая иммунизация не защищала детей от паралича.
Западное полушарие также столкнулось с проблемой растущего числа случаев ОВП. Как было упомянуто выше, остров Эспаньола (Доминиканская Республика и Гаити) испытал на себе то, что Центр контроля назвал «вспышкой полиомиелита», начавшегося в июле 2000 г. В Доминиканской Республике, согласно Центру контроля заболеваний, было 54 случая, 12 из которых были «лабораторно подтвержденными случаями полиомиелита, приписываемыми полиовирусу, происходящему от вакцинного вируса типа 1». И хотя известно, что оральная полиовакцина вызывает примерно 1 случай полиомиелита на 750 000 детей, получивших ее, или их матерей (в отличие от инактивированной вакцины Солка, вводимой инъекцией, оральная вакцина Сэбина содержит живые вирусы), 45 случаев, о которых сообщила в январе 2001 г. «Вашингтон пост», если они подтвердятся, явно не впишутся в эту статистику.
Что касается конца февраля 2001 г., причина 33 случаев ОВП в Доминиканской Республике и трех в Гаити остается неизвестной. Все эти случаи могли быть вызваны оральной полиовакциной, и в таком случае загадка была бы решена — оставляя без ответа, однако, вопрос о том, какие факторы способствовали столь сильной вспышке вакцинноассоциированного паралича.
Если эти 36 случаев ОВП не связаны с полиовакциной, тогда что их вызвало? Что является причиной других вспышек неполиовирусных ОВП, идентифицированных ВОЗ по всему миру? И насколько чувствительны применяемые вирусологами современные методики идентификации и изоляции полиовируса в случаях, когда он признан виновником вспышки?
Рекомендации по полиовакцинации
Центр по контролю и предотвращению заболеваний США
Рекомендации для детей в США включают в себя серию из 4-х вакцинаций инактивированным полиовирусом (ИПВ) в возрасте 2, 4, 6-18 месяцев и 4-6 лет. Невакцинированные взрослые должны получить три дозы ИПВ, первые две из которых с интервалом 4-8 недель, и третья — спустя 6-12 месяцев после второй. Если три дозы не могут быть введены с рекомендованными интервалами до того, как потребуется защита, могут быть предложены альтернативные схемы. Для не полностью привитых людей, рекомендуются дополнительные дозы ИПВ, чтобы завершить серию. Дозы ИПВ могут быть признаны бустерными для тех, кто ранее завершил первичную серию вакцинации и кто, возможно, путешествовал в полиоэндемичных районах (Morbidity and Mortality Weekly Report, 2 March 2001, v. 50, № 8, p. 147).
Как полиовирус определяют сегодня?
Поражает воображение, насколько чувствительны и совершенны стали лабораторные технологии за последние 30 лет. В начале 2001 г. мы уже изучаем всю последовательность генома человека, и трудно представить, что только в 1970-х ученые впервые разработали технологию, которая позволила быстрое секвенирование генов, включая генетические последовательности инфекционных агентов, таких как бактерии и вирусы.
Эта новая методология секвенирования была сразу же применена в исследовании полиовируса. В 1970-х гг. Центр контроля заболеваний стал рутинно применять генотипическое тестирование («молекулярное секвенирование» или «олигонуклеотидное снятие отпечатков пальцев») к образцам стула, собранным во время вспышек подозрительных на полиовирус болезней, чтобы определить присутствие вируса. Применив полученные по новой технологии данные к предыдущему десятилетию, Центр контроля заболеваний теперь утверждает, что «лабораторные наблюдения за энтеровирусами и наблюдения случаев полио позволяют предположить, что эндемичная циркуляция природного дикого полиовируса прекратилась в США в 1960-х гг.».
Чтобы определить полиовирус в наши дни, согласно указаниям Центра контроля заболеваний и ВОЗ, у каждого пациента нужно взять два образца стула с интервалом в 24-48 часов в течение 14 дней с начала паралича, и они должны быть доставлены в лабораторию в «хорошем состоянии». Хотя ВОЗ ставит целью получить по два хороших образца по крайней мере в 80% всех случаев ОВП, в некоторых регионах мира этого удается достичь лишь на 50%.
Центр контроля заболеваний дает следующие указания, как определять полиовирус:
«Следующие тесты должны быть выполнены на соответствующих образцах, собранных у людей, подозреваемых в заболевании полиомиелитом: а) изоляция полиовируса в тканевой культуре; б) серотипирование полиовирусного изолята как серотип 1, 2 или 3; в) внутривидовая дифференциация с применением скрещивания образцов ДНК/РНК или полимерной цепной реакции для определения принадлежности полиовирусного изолята к вакцинному или к дикому видам.
Образцы сывороток, полученных в острой фазе и в фазе выздоровления, должны быть протестированы на нейтрализующие антитела каждого из трех полиовирусных серотипов. Четырехкратный рост титра антител между образцами вовремя взятых сывороток острой фазы и фазы выздоровления свидетельствует о полиовирусной инфекции. Должен быть использован пересмотренный недавно стандартный протокол серологического исследования полиовируса. Коммерческие лаборатории обычно применяют фиксацию комплемента и другие тесты. Однако иные анализы, кроме нейтрализации, трудно интерпретировать из-за недостаточной стандартизации и относительной нечувствительности».
Поскольку эта процедура является старым добрым методом обнаружения полиовируса и ответной реакции организма, она не «изолирует» полиовирус, а просто обнаруживает его. Образцы, тестированные Центром контроля заболеваний и ВОЗ, должны описываться как «полиовирусные реактивы», а не образцы, содержащие изолированный, чистый вирус.
И снова, у нас нет доказательства, что полиовирус был изолирован.
Если не полиовирус, то что сегодня вызывает случаи вялого паралича?
«История этиологии полиомиелита — это история ошибок«.
Дж. Ф. Эггерс «Medicine», 1954
Если большинство населения США иммунизируется с 1950-х гг., то почему «искоренение» полиовируса в пределах Соединенных Штатов продолжалось до 1979-го года? И что служит причиной продолжающихся случаев неполиовирусного паралича по всему миру?
Становится ясно, что один и тот же виновник, способный вызвать не только паралич, но также и другие неврологические осложнения, это органофосфатные пестициды. Недавние исследования связали хроническое воздействие органофосфатных пестицидов с развитием признаков и симптомов болезни Паркинсона на модели животных. И исследователи из Парагвая имеют достаточные доказательства того, что вспышка ОВП среди детей в 1990-1991 гг. была связана с воздействием органофосфатного пестицида.
У 50-и парагвайский детей, выявленных в этом исследовании — оно проводилось в изолированном сельском районе, а потому, как отмечают исследователи, значительное количество пораженных детей могло быть исключено из исследования — развилась разновидность ОВП, именуемая cиндромом Гийена-Барре. Как и в случае других форм ОВП, миелиновая оболочка, которая окружает и защищает нервы, повреждается при этом синдроме. Причины заболевания неизвестны, но принято считать, что ими являются аутоиммунные процессы, спровоцированные инфекциями, токсинами или комбинацией того и другого.
У детей, заболевших во время парагвайского лета (с января по апрель), наблюдались слабость, инфекция верхних дыхательных путей, лихорадка и желудочно-кишечные симптомы. У трех детей было затрудненное дыхание, и двоим из них потребовалась механическая помощь в дыхании (интубация). «Слабость прогрессировала по восходящей у 95% детей, и одновременно во всех конечностях — у 5%; в среднем, время до низшей точки болезни занимало 7 дней (диапазон 2-12 дней)», — сообщали исследователи. Из 35 детей, наблюдаемых на острой стадии ОВП, 18 не могли ходить, 10 ходили с посторонней помощью, четверо ходили самостоятельно, и трое были слишком малы, чтобы ходить. У детей был полный или частичный паралич лицевых мышц и мочевого пузыря; у них также наблюдались изменения в вегетативной нервной системе, которые создавали колебания кровяного давления, неустойчивое сердцебиение, приток крови к коже и кишечную перистальтику. Один ребенок умер.
Исследование было проведено в рамках усилий Панамериканской организации здравоохранения по искоренению полиомиелита. Дэвид Е. Харт из Американского Национального института неврологических нарушений и инсульта при Национальном институте здоровья был ведущим исследователем, работавшим вместе с исследователями из парагвайского Министерства здравоохранения. Они подчеркивали, что большинство случаев сконцентрировалось в сельской фермерской провинции Концепсьон (Concepción).
«Большое количество пациентов в Концепсьоне может быть связано с использованием органофосфатных пестицидов на хлопковых полях», — высказали предположение Харт и его коллеги. «Фермеры используют эти пестициды в огромных количествах, часто в виде концентратов, а пустые контейнеры служат игрушками. Кроме того, максимальное использование органофосфатов происходит летом (декабрь-март)», когда эти дети заболели.
Отмечая, что ретроспективное измерение воздействия органофосфатов очень затруднительно, Харт и его коллеги тем не менее сообщают, что хлопковая промышленность официально истратила в 1991 г. около 6,7 миллионов американских долларов на органофосфатные пестициды. Но более половины пестицидов, используемых в Парагвае, получены «неофициально», согласно этому докладу.
«Четверо детей были исключены из этого исследования из-за очевидного воздействия на них этого продукта и проявления сопутствующего холинергического синдрома», тяжелого заболевания, вызываемого воздействием органофосфатного пестицида. Харт и его коллеги добавили, что «течение их болезни, однако, было подобно таковому у исследуемых детей».
Исследование возможной связи наблюдаемого ОВП у этих парагвайских детей с органофосфатными пестицидами было внеплановым шагом Харта и коллег, который часто не предпринимается. Массовые заболевания могут происходить по любым причинам, не только из-за инфекционных агентов. Токсины в окружающей среде являются важными факторами во многих заболеваниях.
Со времен Коха бактериологи применяют его золотой стандарт, приписывающий процесс заболевания единичному организму. Бактерии и грибки действительно можно выделить и вырастить независимо, на искусственной среде; им не требуется присутствие человеческих или других клеток. Проблемой, с которой столкнулись исследователи при описании небактериологических болезней, было предположение, что единичный организм может вызвать их сам, без взаимодействия с клетками, на которых он размножается, генома человека или окружающей среды.
Мы живем в очень важное время: мы близки к тому, чтобы пересмотреть многое из того, что мы знаем о медицинской науке. В 2001 г. два ошеломляющих доклада по проекту генома человека, опубликованные одновременно в февральских номерах «Сайенс» и «Нэчур», перевернули бóльшую часть наших представлений о геноме человека. Например, мы узнали, что вместо 100 000 генов человеческий геном состоит всего лишь из около 30 000 — меньше, чем у риса.
Наше новое представление о геноме человека обязано частично новым технологиям, которые мы теперь можем применить для перепроверки многих допущений современной медицины. Одним из наиболее важных уроков, извлеченных из сложной задачи расшифровки генома человека, является необходимость точного описания учеными лабораторных экспериментов и результатов. Технологически передовые инструменты могут обеспечить детальную и точную информацию, но исследователи, применяющие их, должны описывать эти результаты с неменьшей точностью. Если образец демонстрирует реактивные свойства в лаборатории, его не должны считать инфекционным. Аналогично этому, суспензии из тканей зараженного мозга не должны называться «вирусом», а растворы матерала ткани мозга не должны называться «изолятами».
Чем точнее мы фокусируемся на геноме человека, тем точнее будет становиться наше понимание взаимодействия генов друг с другом, с окружающей средой и другими организмами.
Точность также должна распространяться и на предметы исследований. Несомненно, утверждение о том, что полиомиелит был искоренен во многих странах, некорректно. Удивительно большое число неполиовирусных случаев ОВП по всему миру обуславливает продолжение усилий по достижению первоначальной цели Марша десятицентовиков (March of Dimes, благотворительная организация в США, собирающая средства на борьбу с недоношенностью, врожденными дефектами развития и детской смертностью; первоначально была создана в 1938 г. президентом США Ф. Д. Рузвельтом как Национальный фонд по борьбе с детским параличом — прим. перев.), а именно элиминации детского паралича. На своем веб-сайте Марш десятицентовиков заслуженно приписывает себе определенную заслугу в ограничении числа параличей в мире сегодня: «Историки называют победу над полиомиелитом одним из величайших достижений века, — утверждается на страницах веб-сайта. — Благодаря Маршу десятицентовиков и миллионам людей, которые поддерживали нас, у нас больше нет ужасающих эпидемий, терроризировавших предыдущие поколения».
Очевидно, что первоначальная цель Марша десятицентовиков не достигнута, иначе бы сегодня в мире не было так много ОВП. Проверка исследований полиомиелита за последние 50 лет показала, что цель искоренения детского паралича была заменена целью искоренения полиовируса. И если правительства, международные организации здравоохранения и благотворительные фонды поддерживают сотнями миллионов долларов усилия по искоренению полиовируса, разве не следует нам инвестировать и в фундаментальные исследования по предотвращению всех случаев детского паралича?
http://www.1796kotok.com/vaccines/malady/polio2.htm